Ингибиторы ксантиноксидазы. Что такое Ксантинурия

Препараты этой группы являются антагонистами естественных метаболитов. При наличии опухолевых заболеваний используют в основном следующие вещества (см. структуры).

Антагонисты фолиевой кислоты: Метотрексат (аметоптерин).

Антагонисты пурина: Меркаптопурин (леупурин, пуринетол).

Антагонисты пиримидина: Фторурацил (флуороурацил); Фторафур (тегафур); Цитарабин (цитозар).

Рисунок 11.Химические структуры ряда метаболитов и их антиметаболитов.

Химически антиметаболиты лишь похожи на естественные метаболиты, но не идентичны им. В связи с этим они вызывают нарушение синтеза нуклеиновых кислот.

Это отрицательно сказывается на процессе деления опухолевых клеток и приводит их к гибели.

Действуют антиметаболиты на разных этапах синтеза нуклеиновых кислот, ингибируя ферменты их синтеза. Так, механизм антибластомного эффекта метотрексата, очевидно, заключается в том, что он угнетает дигидрофолатредуктазу, а также тимидил-синтетазу. Это нарушает образование пуринов и тимидина, в результате чего угнетается синтез ДНК. Меркаптопурин, по-видимому, препятствует включению пуринов в полинуклеотиды. Полагают, что фторурацил нарушает синтез нуклеотидов или тимидина и их включение в ДНК. Имеются данные о том, что в клетках опухоли фторурацил превращается в 5-фтор-2-дезокси-уридин-5-монофосфат, который является ингибитором фермента тимидил-синтетазы.

55. Нарушения обмена нуклеотидов: оротацидурия, ксантинурия. (ксантинурия маловато)

Оротацидурия

Это единственное нарушение синтеза пиримидинов de novo. Оно вызвано снижением активности УМФ-синтазы, которая катализирует образование и декарбоксилирование ОМФ. Поскольку в эмбриогенезе от образования пиримидинов de novo зависит обеспечение синтеза ДНК субстратами, то жизнь плода невозможна при полном отсутствии активности этого фермента. Действительно, у всех пациентов с оротацидурией отмечают заметную, хотя и очень низкую активность УМФ-синтазы. Установлено, что содержание оротовои кислоты в моче пациентов (1 г/сут и более) значительно превосходит количество оротата, которое ежедневно синтезируется в норме (около 600 мг/сут). Снижение синтеза пиримидиновых нуклеотидов, наблюдающееся при этой патологии, нарушает регуляцию КАД-фермента по механизму ретроингибирования, из-за чего возникает гиперпродукция оротата.

Клинически наиболее характерное следствие оротацидурии - мегалобластная анемия, вызванная неспособностью организма обеспечить нормальную скорость деления клеток эритроцитарного ряда. Её диагностируют у детей на том основании, что она не поддаётся лечению препаратами фолиевой кислоты.

Недостаточность синтеза пиримидиновых нуклеотидов сказывается на интеллектуальном развитии, двигательной способности и сопровождается нарушениями работы сердца и ЖКТ. Нарушается формирование иммунной системы, и наблюдается повышенная чувствительность к различным инфекциям.

Гиперэкскреция оротовои кислоты сопровождается нарушениями со стороны мочевыводя-щей системы и образованием камней. При отсутствии лечения больные обычно погибают в первые годы жизни. При этом оротовая кислота не оказывает токсического эффекта. Многочисленные нарушения в работе разных систем организма вызваны "пиримидиновым голодом".

Для лечения этой болезни применяют уридин (от 0,5 до 1 г/сут), который по "запасному" пути превращается в УМФ.

Уридин + АТФ → УМФ + АДФ.

Нагрузка уридином устраняет "пиримидиновый голод", а поскольку из УМФ могут синтезироваться все остальные нуклеотиды пиримидинового ряда, то снижается выделение оротовои кислоты из-за восстановления механизма ретроингибирования КАД-фермента. Для больных оротацидурией лечение уридином продолжается в течение всей жизни, и этот нуклеозид становится для них незаменимым пищевым фактором.

Кроме генетически обусловленных причин, оротацидурия может наблюдаться:

при гипераммониемии, вызванной дефектом любого из ферментов орнитинового цикла,

за исключением карбамоилфосфат- синтетазы I. В этом случае карбамоилфосфат, синтезированный в митохондриях, выходит в цитозоль клеток и начинает использоваться на образование пиримидиновых нуклеотидов. Концентрация всех метаболитов, в том числе и оротовой кислоты, повышается. Наиболее значительная экскреция оротата отмечается при недостаточности орнитинкарбамоилтрансферазы (второго фермента орнитинового цикла);

в процессе лечения подагры аллопуринолом, который превращается в оксипуринолмононуклеотид и становится сильным ингибитором УМФ-синтазы. Это приводит к накоплению оротовой кислоты в тканях и крови.

Ксантинурия – наследственная энзимопатия, связанная с дефектом ксантиноксидазы , что приводит к нарушению катаболизма пуринов до мочевой кислоты. В плазме крови и моче может наблюдаться 10-ти кратное снижение уровня мочевой кислоты, но увеличивается в 10 и более раз экскреция ксантина и гипоксантина. Основное клиническое проявление – образование ксантиновых конкрементов, величиной до нескольких миллиметров, коричневого цвета, сравнительно мягкой консистенции. Постепенно может развиться патология почек.

КСАНТИНОКСИДАЗА [ксантин: кислород оксидоредуктаза; КФ 1.2.3.2 ; син.: гипоксантиноксидаза, альдегидраза, фермент Шардингера, ксантин (и альдегид) -> O 2 трансгидрогеназа ] - фермент, катализирующий окисление ксантина, гипоксантина и альдегидов с поглощением кислорода и образованием соответственно мочевой кислоты, ксантина или карбоновых кислот и супероксидных радикалов O 2 2- . К. является важным ферментом обмена пуринов, катализирующим реакцию, завершающую образование мочевой к-ты в организме животных и человека (см. Пуриновые основания). В катализируемых К. реакциях образуются супероксидные радикалы, используемые в процессах перекисного окисления ненасыщенных жирных к-т и в дезинтоксикации чужеродных соединений в норме и при патол, состояниях.

При генетически обусловленном врожденном дефекте К. и нарушении реабсорбции ксантина в почечных канальцах развивается заболевание, называемое ксантинурией. Оно характеризуется выделением с мочой очень большого количества ксантина и тенденцией к образованию ксантиновых камней; при этом содержание мочевой кислоты (см.) в сыворотке крови (норма 2,0-5,0 мг%) и моче (норма 0,4-1,0 г в суточном количестве) резко снижено. Есть данные о том, что генетическая недостаточность К. наследуется по рецессивному типу.

К. широко распространена в природе. Высокоочищенные препараты К. получают из молока, из печени млекопитающих и птиц. К. встречается и у микроорганизмов. Мол. вес (масса) К.- ок. 300 000. Молекула К. состоит из двух субъединиц, мол. вес (масса) каждой из которых равен ок. 150 000. В качестве простетических компонентов молекула К. содержит две молекулы ФАД и два атома молибдена, 8 атомов негеминового железа и 8 атомов кислотолабильной серы. К. отличается широкой субстратной специфичностью, она обладает свойством окислять не только ксантин (см.), но также различные производные пуринов, пиримидинов, птеридинов, разнообразные альдегиды, восстанавливая при этом не только кислород, но и многие другие акцепторы электронов (тетразолиевые соли, производные индофенола, метиленовый синий). Полагают, что в тканях млекопитающих преобладает дегидрогеназная (редуктазная) форма фермента, обладающая свойством восстанавливать НАД в процессе окисления ксантина. При выделении и очистке фермент обычно трансформируется в оксидазную форму. Различают два вида трансформации К.: обратимую (инициируемую окислением SH-групп фермента, их меркаптидированием, образованием смешанных дисульфидов) и необратимую (инициируемую частичным протеолизом фермента или алкилированием его SH-групп). Коммерческие препараты К. уже трансформированы; они не обладают дегидрогеназной активностью.

Методы измерения активности К. основаны обычно на регистрации образования мочевой к-ты по увеличению оптической плотности р-ра при 295 нм при окислении ксантина в присутствии O 2 .

Библиография: Горкин В. 3. Трансформация ферментов, Молекулярная биол., т. 10, в. 4, с. 717, 1976, библиогр.; Маккьюсик В. А. Наследственные признаки человека, пер. с англ., с. 432, М., 1976; The enzymes, ed. by P. D. Boyer, v. 10, N. Y., 1971; W a u d W. R. a. R a j a g o p a-1 a n K. V. The mechanism of conversion of rat liver xanthine dehydrogenase from an NAD+-dependent form (type D) to an 02-dependent form (type O), Arch. Biochem., v. 172, p. 365, 1976.

ПРОБЛЕМНЫЕ СТАТЬИ

УДК 577.152.173

КСАНТИНОКСИДАЗА КАК КОМПОНЕНТ СИСТЕМЫ ГЕНЕРИРОВАНИЯ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА

В.В. Сумбаев, к.б.н., А.Я. Розанов, д.м.н., проф.

Одесский государственный университет им. И.И. Мечникова

Ксантиноксидаза была открыта независимо друг от друга украинским ученым Горбачевским и немецким Шардингером. Этот фермент (КФ: 1.2.3.2) катализирует превращение гипоксантина в ксантин и далее в мочевую кислоту, а также окисление ряда птеридинов, альдегидов и имидазолов . При дефиците кислорода ксантиноксидаза функционирует как НАД + -зависимая ксантиндегидрогеназа (КФ: 1.2.1.37), причем механизмы действия этих двух функциональных форм принципиально различаются . В конце 1980-х годов изучение ксантиноксидазы становилось все более актуальным в связи с открытием мощной супероксидобразующей, канцерогенной и апоптогенной активностей фермента . Началась "вторая волна" исследований роли ксантиноксидазы в биохимических процессах, когда выяснилось, что ксантиноксидаза является главной системой генерирования активных форм кислорода в живых организмах.

Основная функция ксантиноксидазы состоит в образовании мочевой кислоты из первичных продуктов окисления аденина и гуанина. Ксантиноксидаза (ксантиндегидрогеназа) занимает, фактически, центральное место в распаде пуринов. Эти две функциональные формы являются основным фактором, лимитирующим образование мочевой кислоты в животном организме . Как уже было сказано, мочевая кислота у некоторых животных, в том числе и у человека, является конечным продуктом распада пуринов, в связи с чем интенсивность утилизации продуктов дезаминирования пуринов у них прямо зависит от активности ксантиноксидазы и ксантиндегидрогеназы . У других же организмов, способных расщеплять мочевую кислоту, интенсивность распада мочевой кислоты и последующих компонентов целиком зависит от активности ксантиноксидазы и ксантиндегидрогеназы, так как активность уриказы прямо зависит от количества образующейся мочевой кислоты . Ксантиноксидаза и ксантиндегидрогеназа обеспечивают утилизацию всего "лишнего" ксантина, который при недостаточной утилизации способен вызывать миалгии и инфаркты почек .

У животных, растений и аэробных микроорганизмов мочевая кислота образуется в ходе ксантиноксидазной реакции, и только незначительная её часть образуется по ксантиндегидрогеназному пути .

Структура и механизмы действия ксантиноксидазы и ксантиндегидрогеназы

Структурная организация ксантиноксидазы (ксантиндегидрогеназы) достаточно сложна. Фермент имеет димерную структуру, причем при разделении его на мономеры обнаруживается, что каждый из них в отдельности обладает каталитической активностью . Молекулярная масса фермента, определенная при помощи диск-электрофореза в ПААГ, составляет 283 кД . Каждый мономер состоит из трех неидентичных субъединиц, связанных между собой дисульфидными связями. Молекулярная масса субъединиц, определённая тем же методом, сотавляет соответственно 135, 120 и 40 кД . В состав фермента входит ФАД, ковалентно связанный с его белковой частью. На каждый мономер приходится одна молекула ФАД. Белковая часть фермента богата цистеином и содержит 60–62 свободные SH-группы. В структуре ксантиноксидазы имеются также железосерные центры с типом кластера 2 Fe - 2 S. В состав фермента входит молибден, который в невозбуждённом состоянии пятивалентен и находится в виде так называемого молибденового кофактора - он связан двумя s-связями с ФАД, двумя - с шестизамещённым птерином, протонированным в положении 7 и одной - с серой цистеина. Показано, что в состав ксантиноксидазы в расчёте на каждый мономер входит также одна надсульфидная группа (- S - SH), которая, возможно, и служит для связывания молибдена . В ходе исследований было установлено, что птерин и надсульфидная группа не принимают непосредственного участия в каталитическом акте . В гомогенном состоянии фермент быстро инактивируется из-за конформационных изменений, возникающих благодаря наличию большого числа свободных SH-групп . Показано, что фермент способен постепенно утрачивать молибден . Выяснилось, что активность ксантиноксидазы и ксантиндегидрогеназы прямо зависит от содержания молибдена в организме .

Механизм действия ксантиноксидазы достаточно сложен. Первоначально происходит окисление железа в составе железосерного центра фермента с образованием супероксидного радикала . ФАД дегидрирует субстрат, превращаясь в сверх активный семихинон, способный дегидрировать даже воду с образованием ФАДН 2 , немедленно восстанавливающего супероксид в Н 2 О 2 . Оставшийся у ФАД электрон может восстановить окислившийся железосерный центр. Два гидроксила, образовавшиеся в результате дегидрирования воды на двух мономерах ксантиноксидазы, конденсируются в молекулу Н 2 О 2 . Отдавая электрон, молибден расщепляет перекись водорода на ОН · и ОН - , изменяя при этом свою валентность. Возбужденный молибден связывается с гидроксил-анионом, отнимает у него утраченный электрон и гидроксилирует субстрат, передавая последнему гидроксильный радикал . Схематически механизм действия ксантиноксидазы представлен на рис. 1 .

Механизм действия ксантиндегидрогеназы относительно прост по сравнению с механизмом действия ксантиноксидазы. Первоначально фермент атакует p-связь в структуре субстрата. Происходит это следующим образом: молибден отдает электрон, разрывает p-связь между n и c в положениях 2 и 3 или 7 и 8 в структуре пуринового ядра субстрата с присоединением электрона к азоту. Активированный субстрат легко присоединяет воду, вода диссоциирует на Н + и ОН - , после чего протон присоединяется к азоту, а молибден связывается с гидроксил-анионом, отнимает у него утраченный электрон и гидроксилирует субстрат, передавая последнему гидроксильный радикал. Таким образом, субстрат гидратируется. Образовавшийся гидрат субстрата легко дегидрируется при участии ФАД, который тут же окисляется, передавая электроны и протоны на НАД + , являющийся конечным акцептором электронов и протонов в данной реакции . В случае с ксантиндегидрогеназой железосерные центры не функционируют и супероксид не образуется. В связи с этим реакция идёт по более медленному дегидрогеназному пути через стадию гидратации субстрата. В случае же с ксантиноксидазой образуется супероксид, в связи с чем реакция должна идти быстрее, ввиду необходимости его обезвреживания. Именно поэтому гидратации субстрата не происходит и субстрат немедленно подвергается дегидрированию .

Регуляция активности ксантиноксидазы

Как мы уже упоминали, путь, по которому осуществляется преваращение гипоксантина в ксантин и далее в мочевую кислоту, зависит в первую очередь от условий, в которых функционирует фермент, отвечающий за данный процесс. При дефиците кислорода, снижении рН, а также избытке никотинамидных коферментов ксантиноксидаза функционирует как НАД-зависимая ксантиндегидрогеназа . Индукторами активности ксантиноксидазы являются интерферон и молибдаты . Интерферон индуцирует экспрессию генов, кодирующих субъединицы ксантиноксидазы, а молибден (в составе молибдатов) активирует высвобождение ксантиноксидазного апофермента из пузырьков аппарата Гольджи, что приводит к увеличению количества активных молекул ксантиноксидазы. Следует заметить, что активность ксантиноксидазы в значительной степени зависит от поступления в организм экзогенного молибдена. Суточная потребность человека в молибдене составляет 1-2 мг . Показано, что в раковых клетках активность ксантиноксидазы повышается в 5-20 раз . Кроме того, восстановители, такие как аскорбиновая кислота, глутатион и дитиотреитол, в концентрациях 0,15-0,4 мМ активируют ксантиноксидазу, поддерживая ФАД и железосерные центры в структуре фермента в восстановленном состоянии, что увеличивает количество образуемого ферментом супероксида и, соответственно, количество окисленных молекул субстрата. При концентрациях 0,6 мМ и выше все восстановители неконкурентно ингибируют ксантиноксидазу. Ингибирующий эффект может быть обусловлен конкуренцией между восстановителями и ферментом за присоединение молекулярного кислорода, а также гиперредукцией ФАД, что затрудняет нормальное дегидрирование субстрата . Все описанные восстановители при концентрациях 0,1 мМ и выше неконкурентно ингибируют ксантиндегидрогеназу, что обусловлено редукцией ФАД, вызывающей торможение дегидрирования гидратов субстрата, которые, в свою очередь, как неустойчивые соединения распадаются на субстрат и воду . Ингибиторами ксантиноксидазной активности являются вольфраматы. Вольфрам замещает молибден в активном центре фермента, что приводит к его необратимой инактивации . Кроме того, изомер гипоксантина - аллопуринол, а также многие производные птеридина (в том числе фолиевая кислота) и имидазола (гистидин) изостерически ингибируют ксантиноксидазу . Конкурентным ингибитором ксантиноксидазы является также кофеин (1,3,7-триметилксантин). Однако, попадая в животный организм, кофеин деметилируется до 1-метилксантина и не может быть ингибитором ксантиноксидазы. Более того, данный метаболит превращается при участии ксантиноксидазы в 1-метилмочевую кислоту . Мощными изостерическими ингибиторами ксантиноксидазы, обезвреживающими, кроме того, образуемый ею супероксид, являются производные диарилтриазола . В структуре ксантиноксидазы имеется аллостерический центр, представленный, как было рассчитано, одним остатком гистидина, одним остатком серина, двумя остатками тирозина и одним остатком фенилаланина. Аллостерическими ингибиторами ксантиноксидазы являются кортикостероиды, полихлорбифенилы и полихлордибензодиоксины, связывающиеся с аллостерическим центром фермента. Интересно отметить, что аллостерические ингибиторы ксантиноксидазы снижают продукцию ферментом супероксида . На рис. 3 показано расположение 4,9-дихлордибензодиоксина в аллостерическом центре ксантиноксидазы.

Субстратная специфичность ксантиноксидазы и ксантиндегидрогеназы

Ксантиноксидаза и ксантиндегидрогеназа не являются строго специфичными к гипоксантину и ксантину и могут катализировать окисление около тридцати алифатических и ароматических альдегидов . Кроме этого, обе функциональные формы фермента могут окислять различные птерины (2,6-диоксиптеридин и др.) до оксиптеринов, а также аденин до 2,8-диоксиаденина . Установлено, что обе функциональные формы фермента окисляют гистидин в 2-оксигистидин . Механизм окисления такой же, как и в случае с гипоксантином и ксантином. Известно также, что кислородзависимая форма фермента (то есть непосредственно ксантиноксидаза) окисляет цистеин в цистеинсульфинат . Дегидрированный цистеин захватывает гидроксил, связанный с молибденом, превращаясь в цистеинсульфенат, окисляющийся в присутствии Н 2 О 2 в цистеинсульфинат . Ксантиноксидаза способна проявлять НАД-диафоразную активность, а также окислять оксид азота (NO) в NO 2 - .

Локализация ксантиноксидазы и ксантиндегидрогеназы в тканях животного организма

Ксантиноксидаза и ксантиндегидрогеназа присутствуют практически во всех тканях животного организма. Наивысшей удельной активностью эти две функциональные формы обладают в печени, в цитозоле гепатоцитов, Купферовских клеток и эндотелиальных клеток . Практически вся мочевая кислота в организме образуется именно в печени . После печени по количеству ксантиноксидазы (ксантиндегидрогеназы) следуют слизистая оболочка тонкого кишечника, где удельная активность фермента на порядок ниже, чем в печени, а затем почки и головной мозг, однако в данных органах удельная активность ксантиноксидазы довольно низка . В больших количествах фермент присутствует также в молоке, которое очень часто служит объектом для его выделения .

Роль ксантиноксидазы, как генератора активных форм кислорода, в биохимических процессах

В 1991 г. было установлено, что повышение активности ксантиноксидазы вызывает достоверное увеличение активности супероксиддисмутазы и каталазы . В последние годы было установлено, что при повышении активности ксантиноксидазы увеличивается активность глутатионпероксидазы. Так как в результате ксантиноксидазной реакции происходит образование большого количества перекиси водорода, то такой процесс вполне возможен . В то же время, ксантиноксидаза является мощным образователем супероксидного радикала (на каждый мономер фермента приходится только 1 молекула ФАД и два железосерных центра, в связи с чем супероксид может образовываться в избытке ), способного индуцировать процессы свободнорадикального окисления с образованием органических гидроперекисей. Se-зависимая глутатионпероксидаза разрушает гидроперекиси. В связи с этим активность глутатионпероксидазы также может повышаться . Нами установлено, что индукция ксантиноксидазы натрия молибдатом вызывает активацию глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы, а также снижает восстановительный потенциал глутатиона в печени крыс. Уровень диеновых конъюгатов при этом значительно повышается, а содержание малонового диальдегида практически не изменяется. Подавление ксантиноксидазной активности у крыс введением специфического ингибитора - вольфрамата натрия вызывает обратный эффект - снижение активностей глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы, увеличение восстановительного потенциала глутатиона в печени животных. Показатели перекисного окисления липидов (количество диеновых конъюгатов и малонового диальдегида) при этом значительно снижаются .

Как мы уже отмечали, на каждый мономер ксантиноксидазы приходится одна молекула ФАД, обезвреживающая супероксид, и два железосерных центра, генерирующих его, в связи с чем данный радикал может образовываться в избытке. Кроме того, супероксид является предшественником других активных форм кислорода - гидроксильного радикала и перекиси водорода. Установлено, что повышение количества активных форм кислорода не только индуцирует процессы свободнорадикального перекисного окисления липидов, но и вызывает повреждения ДНК, что сопровождается возникновением точковых мутаций . Получены убедительные доказательства в пользу того, что повреждение ДНК активными формами кислорода, генерируемыми ксантиноксидазой, приводит к трансформации нормальной клетки в раковую . Установлено также, что индукция активности ксантиноксидазы протекает практически во всех случаях одновременно с индукцией активности синтазы оксида азота за счет активации экспрессии генов ее индуцибельной изоформы . Синтаза оксида азота (NO-синтаза, NOS - nitric oxide synthase, КФ 1.14.13.19) катализирует образование NO и цитруллина из аргинина и О 2 через N-оксиаргинин . В качестве донора электронов фермент использует NADH+H + . NOS в организме животных представлена тремя изоформами - индуцибельной (iNOS) и двумя конститутивными - эндотелиальной (eNOS) и нейрональной (nNOS). Все три изоформы состоят из гомодимеров, включающих редуктазный, оксигеназный и кальмодулинсвязывающий домены, обладают сходным механизмом действия, а различаются молекулярной массой . Для проявления каталитической активности NOS требуются кофакторы - кальмодулин, Са 2+ , (6R) - 5, 6, 7, 8-тетрагидро-L-биоптерин, FAD и FMN. Функцию каталитического центра выполняет тиолсвязанный гем . Установлено, что ксантиноксидаза и индуцибельная синтаза оксида азота имеют, в основном, общие индукторы, такие как, например, интерферон в одинаковой степени индуцирующий активность ксантиноксидазы и NO-синтазы . Показано, что супероксид легко взаимодействует с NO с образованием ядовитого пероксинитрита (ONOO -). Пероксинитрит еще более активно, чем супероксид повреждает ДНК, а кроме того, мембраны клеток стенок сосудов, облегчая таким образом проникновение раковых клеток через них .

Супероксид, NO и пероксинитрит являются лигандами гема и поэтому легко ингибируют активность всех изоформ цитохрома Р450 . Кроме того, данные соединения подавляют экспрессию генов, кодирующих любые изоформы цитохрома Р450 .

Генерируемый ксантиноксидазой супероксид, а также NO, но не пероксинитрит, при высоких концентрациях являются индукторами апоптоза (генетически запрограммированной гибели) клеток . Именно из-за образования пероксинитрита при взаимодействии супероксида и NO одновременная индукция ксантиноксидазы и синтазы оксида азота в раковых клетках препятствует их гибели по механизму апоптоза . Супероксид или NO (но не пероксинитрит) взаимодействуют с тиоредоксином, высвобождая связанную с ним треонин/тирозиновую протеинкиназу ASK-1 (Apoptotic signal regulating kinase 1), ответственную за активацию экспрессии гена, кодирующего белок р53 - главный апоптогенный белок . Этот белок предотвращает возможность митотического деления клетки, подавляя активность митогенного фактора МРF. МРF состоит из циклина А, который связывается с тирозиновой протеинкиназой р33cdk2. Комплекс циклин А-р33cdk2 связывается, в свою очередь, с транскрипционным фактором E2F и фосфорилирует белок p107Rb. Связывание этих четырех белков в промоторных участках активирует гены, необходимые для репликации ДНК. Белок, во-первых, ингибирует фосфорилирование белка р107Rb - члена митогенного фактора МРF, а, во-вторых, вызывает синтез белка р21 - ингибитора циклинзависимых тирозинкиназ .

Белок, р53 устраняет кальциевый барьер и ионы Са 2+ в большом количестве проникают внутрь клетки, где активируют Са 2+ -зависимую эндонуклеазу, расщепляющую ДНК , а также кальций-зависимые протеиназы - кальпаины I и II . Кальпаины I и II активируют протеинкиназу С, отщепляя от нее пептидный фрагмент, подавляющий активность данного фермента, а также расщепляют белки цитоскелета. На этой стадии р53 активирует, кроме того, биосинтез цистеиновых протеиназ - каспаз. Каспазы (caspase - цистеиновые протеиназы, расщепляющие белки по остаткам аспарагиновой кислоты) расщепляют поли-(АДФ-рибозо)-полимеразу (ПАРП), которая синтезирует поли-АДФ-рибозу из НАД+. Поли-АДФ-рибозилирование гистоновых белков хроматина класса 1Н при фрагментации ДНК стимулирует репарацию и препятствует дальнейшей фрагментации ДНК . Основным субстратом каспаз являются интерлейкины 1b-IL. Кроме того, установлено, что каспаза-3 путем ограниченного протеолиза активирует специфическую ДНКазу, которая фрагментирует ДНК на высокомолекулярные фрагменты. В процессе апоптоза на этой же стадии наблюдается активация сериновых протеиназ - гранзима А и гранзима В, расщепляющих гистоновые и негистоновые белки хроматина, а также белки ядерного матрикса и других ядерных протеиназ неизвестной природы, расщепляющих гистоновые белки и ДНК - топоизомеразы. Предполагают, что активация данных протеиназ опосредуется р53 . Таким образом, ДНК фрагментируется, а жизненно важные белки клетки разрушаются и клетка погибает. Процесс апоптоза завершается за 3-12 часов .

Кроме того, установлено, что генерируемый ксантиноксидазой супероксид вызывает деполяризацию митохондрий, высвобождая из них цитохром с, связывающийся c белком Apaf-1 (Apoptotic protease activating factor) и каспазой 9. Данный комплекс активирует каспазу 3, в свою очередь активирующую каспазы 6, 7, о роли которых в апоптозе было рассказано выше.

Показано, что культивирование клеток в условиях оксидативного стресса, вызванного ксантиноксидазой (создается внесением в культуру высокоочищенного препарата ксантиноксидазы и ксантина), происходит накопление апоптогенного белка р53 и клетки погибают по механизму апоптоза . Активация образования NO в данных условиях ингибирует экспрессию генов, и, соответственно, синтез белка р53, в результате чего клетки не погибают . Доказано, что данный эффект вызывается образованием пероксинитрита при взаимодействии супероксида и NO . То есть, пероксинитрит обладает в данном случае цитопротекторным действием.

В настоящее время механизмы индукции канцерогенеза, а также апоптоза при участии генерируемых ксантиноксидазой активных форм кислорода, остаются мало изученными. Тем не менее, не вызывает сомнений, что ксантиноксидаза, один из наиболее важных ферментов живых организмов, является главной системой генерирования активных форм кислорода.

Литература
1. Мецлер Д. Биохимия: химические реакции в живой клетке: в 3-х т. -М.: Мир, 1976. -Т. 2. -531 с.
2. Hunt J., Massey V. Studies of the reductive half-reaction of milk xanthine dehydrogenase // J. Biol. Chem. 1994. -269, № 29. -P. 18904-18914.
3. Hunt J., Massey V. Redox potentials of milk xanthine dehydrogenase// J. Biol. Chem. 1993. -268, № 33. -P. 24642-24646.
4. Маеда Х., Акаике Т. Оксид азота и кислородные радикалы при инфекции, воспалении и раке // Биохимия. -1998. -63, С. 1007-1020.
5. Фогель Ф., Мотульски А. Генетика человека: в 3-х т.: Пер. с англ. -М.: Мир, 1990. -Т. 2. -357 с.
6. Turner N.A., Doyle W.E., Ventom A.M., Bray R.C. Properties of rabbit liver aldehyde oxidase and the relationships of the enzyme of xanthine oxidase and dehydrogenase// Eur. J. Biochem. -1995. -232. -P. 646-657.
7. Heidelman G. Affective Verhalten und individuelle schwankung-sfreite des serumharnsemrespiegels // Dtsch. Gesundheitsw. -1978. -33, № 1. -P. 36-37.
8. Cabre F., Canela E. Purification, propеrties and functional groops of bovine liver xanthine oxidase // Biochem. Soc. Trans. -1987. -P. 511-512.
9. Edmondson D.E., D"Ardenne S. Election nuclear double resonanse spectroscopy of the desulfo-inhibited molybdenum (V) center in bovine milk xanthine oxidase // Biochemistry -1989. -28, № 14. -P. 5924-5930.
10. Hamilton H. Xanthine oxidase // Bioorg. Chem. -1977. -№2. -P. 135-154.
11. Puing J.G., Mateos F.A., Diaz V.D. Inhibition of xanthine oxidase by allopurinol // Ann. Rheum. Dis. -1989. -48, № 11. -P. 883-888.
12. Yuldiz S. Activation of xanthine oxidase by MoO 3 // Chim.acta Turc. -1988. -16, № 1. -P. 105-117.
13. Emmerson B.T. Disorders of urate metabolism and the formation of renal calculi // Urinary Calc. Int. Urinary Stone Conf. -1981. -P. 83-88.
14. Бабенко Г.А. Микроэлементы в экспериментальной и клинической медицине -Киев: Здоров"я, 1965. -184 с.
15. Сумбаев В.В., Розанов А.Я. Исследование in vitro регуляции активности ксантиноксидазы печени крыс восстановителями-антиоксидантами // Укр. биохим. журн. -1998. -70, № 6. -С. 47-52.
16. Sumbayev V. V. Turnings of cysteine and histidine, catalised by xanthine oxidase // Amino Acids. -1999. -17, № 1. -P. 65-66.
17. Сумбаєв В.В. Вплив аскорбинової кислоти на активнiсть ксантиноксидази // Вiсник Одеського Державного унiверситету. -1998. -№ 2. -С. 123-127
18. Kuppusami P., Zweier J. Characterization of free radical generation by xanthine oxidase. Evidence for hydroxyl radical generation// J. Biol. Chem. -1989. -264, № 17. -P. 9880-9884.
19. Сумбаев В.В. Влияние восстановителей-антиоксидантов и кофеина на активность ксантиндегидрогеназы //Укр.биохим.журн., 1999. -71, № 3. -С. 39-43.
20. Сумбаев В.В., Розанов А.Я. Влияние кофеина на активность ксантиноксидазы // Укр. биохим. журн. -1997. -69, № 5-6. -С. 196-200.
21. Van der Goot H., Voss H.-P., Bast A., Timmerman H. New antioxidants with strong free radical scavenging and xanthine oxidase inhibiting activity// XV Int. Symp. on Med. Chem. Edinburgh. Book of abstracts. -1998. -P. 243.
22. Сумбаев В. В. In vitro влияние кортикостероидов, ДДТ и 4,9-дихлордибензодиоксина на активность ксантиноксидазы печени крыс. Обратная зависимость между активностью ксантиноксидазы и количеством цитохрома Р450 в печени крыс in vivo // Биохимия -2000. -65. -C. 1122-1126.
23. Sumbayev V. V. Calculation of the amino acid structure of xanthine oxidase allosteric center // Amino Acids. -1999. -17, № 1, P. 65-66.
24. Blomstedt J., Aronson P. pH-Gradient-stimulated transport of urate and p-aminohippurate in dog renal microvillus membrane vesicles// J. Clin. Invest. -1980. -65, № 4. -P. 931-934.
25. Hattory Y., Nishino T. Usami et all. Purine and Pyrimidine metab. // Man VI Proc. 6th Int Symp. Human Purine and Pyrimidine metab. -1988. -P. 505-509.
26. Jorgensen P., Poulsen H. Determination of hipoxanthin and xanthine // Acta Pharmac. et Toxicol. -1955. -№ 2. -P. 11-15.
27. Lunqvist G., Morgenstern R. // Mechanism of activation of rat liver microsomal glutathione transpherase by noradrenaline and xanthine oxidase // Biochem. Pharmacol. -1992. -43, № 8. -P. 1725-1728.
28. Radi R., Tan S., Proclanov E.et al. Inhibition of xanthine oxidase by uric acid and its influence on superoxide radical production // Biochim. and Biophys. Acta Protein Structure and Mol. Enzymol. -1992. -122, № 2. -P. 178-182.
29. Reiners J. J., Thai G., Rupp T., Canta A. R. Quantification of superoxide dismutase, catalase, glutathione peroxidase and xanthine oxidase during skin cancer ontogeni// Carcinogenesis. -1991. -12. -P. 2337-2343.
30. Ионов И.А. Витамины Е и С, как компоненты антиоксидантной системы эмбрионов птиц и млекопитающих // Укр. биохим. журн. -1997. -69, № 5-6. -С. 3-11.
31. Cумбаєв В. В. Вплив аскорбінової кислоти та функціонально пов"язаних з нею сполук на активність ксантиноксидази і ксантиндегідрогенази: Автореф. дис. канд. біол. наук. -Київ, 1999. -19 с. 32. Горрен А. К. Ф., Майер Б. Универсальная и комплексная энзимология синтазы оксида азота // Биохимия. -1998. -63, С. 870-880.
33. Брюне Б., Сандау К., фон Кнетен А. Апоптотическая гибель клеток и оксид азота: механизмы активации и антагонистические сигнальные пути // Биохимия -1998. -63, № 7. -С. 966-975.
34. Кобляков В. А. Индукторы суперсемейства цитохрома Р 450 как промоторы канцерогенеза // Биохимия. -1998. -63, С. 1043-1059.
35. Хаценко О. Взаимодействие оксида азота и цитохрома Р 450 в печени // Биохимия. -1998. -63, С. 984-992.
36. Rollet-Labelle E., Grange M. J., Marquetty C. Hydroxyl radical as a potential intracellular mediator of polymorphonuclear neutrophil apoptosis // Free Radic. Biol. Med. -1998. -24, № 4. -P. 563-572.
37. Sen C. K., Packer L. Antioxidant and redox regulation of gene transcription // FASEB J. -1996. -10, № 7. -P. 709-720.
38. Suzuki Y. J., Mezuno M., Tritschler H. J., Packer L. Redox regulation of NF-kappa B DNA binding activity by dihidrolipoate // Biochem. Mol. Biol. Int. -1995. -36, № 2. -P. 241-246.
39. Finkel T. Redox-dependent signal transduction // FEBS Lett. -2000. -476. -P. 52 -54.
40. Матышевская О. П. Биохимические аспекты вызванного радиацией апоптоза // Укр. биохим. журн. -1998. -70, № 5. -С. 15-30.
41. Куцый М. П., Кузнецова Е. А., Газиев А. И. Участие протеаз в апоптозе // Биохимия -1999. -64, № 2. -С. 149-163.
42. Cai J., Yang J., Jones D. P. Mitochondria control of apoptosis: the role of cytochrome c // Biochim Biophys Acta. -1998. -1366. -P. 139-149.

8144 0

Аллопуринол (Allopurinol)
Ингибиторы ксантиноксидазы
Табл. 100 мг; 300 мг

Механизм действия

Ингибирует ксантиноксидазу, предотвращает переход гипоксантина в ксантин и образование из него мочевой кислоты. Уменьшает концентрацию мочевой кислоты и ее солей в жидких средах организма, способствует растворению имеющихся уратных отложений, предотвращает их образование в тканях и почках. Снижая трансформацию гипоксантина и ксантина, усиливает их использование для синтеза нуклеотидов и нуклеиновых кислот.

Накопление в плазме ксантинов не нарушает нормальный обмен нуклеиновых кислот, преципитации и выпадения в осадок ксантинов в плазме не происходит (высокая растворимость). Почечный клиренс ксантинов в 10 раз превышает клиренс мочевой кислоты, увеличение выведения ксантинов с мочой не сопровождается повышенным риском нефролитиаза.

Фармакокинетика

Абсорбируется после однократного перорального приема 300 мг — 80—90%. Проникает в грудное молоко. В печени около 70% дозы метаболизируется в активный метаболит — оксипуринол. После однократного приема 300 мг Сmax аллопуринола (2—3 мкг/мл) — 0,5—2 ч, оксипуринола (5—6 мкг/мл) — 4,5—5 ч. Т1/2 — 1-3 ч (быстрое окисление до оксипуринола и высокая гломерулярная фильтрация), Т1/2 оксипуринола — 12—30 ч (в среднем 15 ч). В почечных канальцах оксипуринол в значительной степени реабсорбируется (механизм реабсорбции аналогичен реабсорбции мочевой кислоты). Около 20% дозы выводится через кишечник в неизмененном виде; почками — 10% аллопуринол, 70% оксипуринол. Гемодиализ эффективен.

Показания

■ Подагра (первичная и вторичная), возникающая при заболеваниях, сопровождающихся усиленным распадом нуклеопротеидов и повышением содержания мочевой кислоты в крови, в т.ч. при paзличных гематобластомах (остром лейкозе, хроническом миелолейкозе, лимфосаркоме и др.), при цитостатической и лучевой терапии опухолей (в т.ч. у детей), псориазе, обширных травматических повреждениях, вследствие ферментных нарушений (синдром Леша-Нихена).
■ Нарушения пуринового обмена у детей.
■ Мочекислая нефропатия с нарушением функции почек (почечная недостаточность).
■ Рецидивирующие смешанные оксалатно-кальциевые почечные камни (при налиличии урикозурии).

Противопоказания

■ Гиперчувствительность
■ Печеночная недостаточность.
■ Хроническая почечна недостаточность (стадия азотемии).
■ Первичный (идиопатический) гемохроматоз.
■ Бессимптомная гиперурикемия.
■ Острый приступ подагры.
■ Беременность.
■ Кормление грудью.

Предостережения

Не следует начинать терапию до полного купирования острого приступа подагры.

Во время лечения следует обеспечивать ежедневный диурез не менее 2 л, поддерживать рН мочи на нейтральном или слабощелочном уровне.

Необходимо учитывать, что при адекватной терапии возможно растворение крупных уратных камней в почечных лоханках и попадание их в мочеточник (почечная колика).

При развитии острого приступа подагры необходимо дополнительно назначить противовоспалительные ЛС (в течение первого месяца лечения рекомендуется профилактический прием НПВП или колхицина).

При нарушении функции почек и печени (повышение риска развития побочных эффектов) необходимо снизить дозы аллопуринола.

С осторожностью комбинировать с видарабином.

Детям назначают только при злокачественных новообразованиях и врожденных нарушениях пуринового обмена.

С осторожностью назначают:
■ при почечной недостаточности;
■ хронической сердечной недостаточности;
■ пациентам с сахарным диабетом;
■ пациентам с артериальной гипертензией.

Взаимодействия

Побочные эффекты

■ Аллергические реакции — кожная сыпь, кожный зуд, крапивница, экссудативная мультиформная эритема, синдром Стивенса-Джонсона, токсический эпидермальный некролиз (синдром Лайелла), пурпура, буллезный дерматит, экзематозный дерматит, эксфолиативный дерматит, редко — бронхоспазм.
■ ЖКТ — диспепсия, диарея, тошнота, рвота, абдоминальные боли, стоматит, гипербилирубинемия, холестатическая желтуха, повышение активности "печеночных" трансаминаз и ЩФ, редко — гепатонекроз, гепатомегалия, гранулематозный гепатит.
■ ЦНС — головная боль, периферическая нейропатия, неврит, парестезии, парез, депрессия, сонливость.
■ Сердечно-сосудистая система — перикардит, повышение АД, брадикардия васкулит.
■ Мочевыделительная система — острая почечная недостаточность, интерстициальный нефрит, повышение содержания мочевины (у пациентов с исходно сниженной функцией почек), периферические отеки, гематурия, протеинурия, импотенция, бесплодие, гинекомастия.
■ Система кроветворения — агранулоцитоз, анемия, апластическая анемия, тромбоцитопения, эозинофилия, лейкоцитоз, лейкопения.
■ Опорно-двигательный аппарат — миопатии, миалгия, артралгия.
■ Органы чувств — извращение вкуса, потеря вкусовых ощущений, нарушение зрения, катаракта, конъюнктивит, амблиопия.
■ Другие реакции — фурункулез, алопеция, сахарный диабет, обезвоживание, носовые кровотечения, некротическая ангина, лимфоаденопатия, гипертермия гиперлипидемия.

Способ применения и дозы

Внутрь по 0,1 — 0,2 г 1—2 р/сут
Максимальная разовая доза: 0,6 г
Максимальная суточная доза: 0,8 г
Средняя суточная доза у детей: 5—20 мг/кг

Передозировка

Симптомы: тошнота, рвота, диарея, головокружение, олигурия.
Лечение: форсированный диурез, гемо-и перитонеальный диализ.

Синонимы

Аллопуринол, Аллопуринола таблетки 0,1 г, Аллупол, Милурит, Пуринол, Аллопуринол-Эгис

Ю.Б. Белоусов

Другим важным ферментативным источником О ~2 и Н202 является ксантиноксидоре­дуктаза, впервые обнаруженная в коровьем молоке более 100 лет назад . У млеко­питающих фермент в нормальных условиях находится преимущественно в ксантинде- гидрогеназной форме (КФ 1.17.1.4, систематическое название «ксантин: НА Д+- оксидоредуктаза») и может обратимо или необратимо переходить в ксантиноксидазу (КФ 1.17.3.2, систематическое название «ксантин:кислород-оксидоредуктаза»), в резуль­тате соответственно образования дисульфидных связей цистеиновых остатков Cys535 и Cys992 (возможно, с участием сульфгидрильных оксидаз ) или ограниченного протеолиза с вовлечением кальций-зависимых протеаз ; интересно, что у птиц фермент представлен только дегидрогеназной формой . При ишемии органов наблюдается быстрая (в течение нескольких минут) трансформация ксантиндегидроге- назы в ксантиноксидазу , и в этот процесс могут вовлекаться АКМ . Такой же быстрый переход фермента в оксидазную форму наблюдается при гомогенизации тка­ней, что существенно затрудняет определение истинного соотношения разных изоформ фермента in vivo.

Рис. 14. Взаимопревращения изоформ ксантиноксидоредуктазы

Основная физиологическая функция фермента - участие в катаболизме пуринов; при этом ксантиндегидрогеназная форма в качестве акцептора электронов использует глав­ным образом НАД+, оксидазная же - молекулярный кислород (рис. 15).

С помощью клонирования ДНК проведён аминокислотный анализ (около 1330 ами­нокислот) ферментов, выделенных из печени человека, крысы, мыши, цыпленка, а также из дрозофилы; они оказались гомологичными на 90 % . Ген, кодирующий ксанти- ноксидазу, локализован в 22 хромосоме человека (участок 2р22) и в 17 хромосоме мыши и содержит 36 экзонов.

Базальная экспрессия ксантиноксидоредуктазы человека низка (особенно по сравне­нию с другими млекопитающими), однако транскрипция фермента существенно усили­вается под действием цитокинов (интерферону, интерлейкин-1, интерлейкин-6, ФНО-а), гормонов (дексаметазон, кортизол, пролактин), липополисахарида, гипоксии; в качестве негативного регулятора выступает гипероксия . Изменение парциального давления кислорода действует и на посттранскрипционном уровне: активность ксантиноксидоре­дуктазы эндотелиоцитов аорты быка в условиях гипоксии повышалась в 2 раза без изме­нения экспрессии мРНК в течение 24 ч (аналогичный эффект снижения р02 на­блюдался и в фибробластах ), а при гипероксии активность фермента падала быст­рее, чем скорость его синтеза de novo . Предполагается, что уменьшение концентрации кислорода способствует фосфорилированию молекулы ксантиноксидоре­дуктазы, в результате чего её ферментативная активность возрастает .

Структурно ксантиноксидоредуктаза представляет собой гомодимер; каждая субъе­диница имеет молекулярную массу около 150 кДа и содержит 3 домена, связанных со специфическими кофакторами (рис. 16). N-концевой домен (аминокислоты 1-165) со­стоит из двух субдоменов, в каждый из которых входит по 1 железосерному центру, ко­ординационно связанному с 4 остатками цистеина; промежуточный домен (аминокисло­ты 226-531) содержит глубокий связывающий карман для ФАД, располагающий флави- новое кольцо в тесной близости к Fe2-S2-HeHTpy; С-концевой домен (аминокислоты 590- 1332) связан с молибденовым кофактором .

Ограниченный протеолиз ксантинокси-

доредуктазы трипсином приводит к образованию трёх фрагментов массой 20, 40 и 85 кДа. Железосерные центры находятся в низкомолекулярном фрагменте 20 кДа, ФАД - во фрагменте 40 кДа, атом молибдена - в высокомолекулярном фрагменте 85 кДа ; все три фрагмента находятся в тесной взаимосвязи и распадаются только в условиях де­натурации . Молибденовый кофактор представляет собой органическое производ­ное птерина (молибдоптерин), содержащее 1 атом молибдена, пентакоординированный двумя дитиоленовыми атомами серы, ещё одним атомом серы и двумя атомами кисло­рода (рис. 17).

Рис. 17. Структура молибденового кофак­тора ксантиноксидазы

Ксантин и гипоксантин окисляются на молибденовом фрагменте, где Мо(У1) восста­навливается до Мо(1У); затем электроны через железосерные центры фермента перено­сятся на ФАД, а с ФАД-содержащего участка - на НАД+ или молекулярный кислород (рис. 16) .

В ранних работах обсуждался вопрос об идентичности ксантиноксидазы и НАДФН- оксидазы фагоцитов , в настоящее время строго установлено, что это разные фер­менты.

У разных видов животных содержание ксантиноксидоредуктазы значительно варьи­рует: так, в тканях человека и кролика её гораздо меньше, чем в тканях крыс и собак . Исследование содержания фермента в разных клетках и тканях показало, что у животных (крысы) в наибольших концентрациях он обнаруживается в гепатоцитах, эпителиальных и эндотелиальных клетках . Данные о содержании ксантиноксидо­редуктазы в тканях и органах человека противоречивы, однако в основном сводятся к
тому, что в наибольших количествах фермент представлен в клетках печени и тонкого кишечника , в то время как в мозге, сердце, лёгких, скелетных мышцах, почках его уровень крайне низок , что противоречит предполагаемой роли ксантинок- сидазы в постишемическом (реперфузионном) повреждении этих органов и тканей (см. Главу 3). Такое расхождение можно объяснить существованием в микрососудах некото­рых тканей отдельных субпопуляций эндотелиоцитов, экспрессирующих очень высокий уровень активности фермента ; при гомогенизации больших фрагментов органов ксантиноксидоредуктаза этих количественно малых субпопуляций «отвечает» за общее содержание фермента. Кроме того, недавно обнаружено, что ксантиноксидоредуктаза локализована не только в цитоплазме, но и на внешней поверхности плазмалеммы эндо­телиоцитов , а также что при ишемии/реперфузии фермент может выделяться из печени и кишечника в системную циркуляцию и связываться с расположенными на поверхности эндотелиальных клеток гликозаминогликанами .

Небольшие количества ксантиноксидоредуктазы обнаруживаются во внеклеточных жидкостях - так, в сыворотке крови человека её активность составляет от 0 до 50 нмоль мочевой кислоты / мин / л , при этом практически вся она находится в оксидазной форме в результате воздействия сывороточных протеаз . Уровень внеклеточного фермента существенно повышается при некоторых патологиях, особенно при заболева­ниях, связанных с повреждением печени - хронический гепатит, цирроз, обтуративная желтуха; при вирусном гепатите, особенно в острой стадии, показано 1000-кратное уве­личение концентрации фермента в сыворотке крови .

В оксидазной форме фермент в качестве акцептора электронов использует молеку­лярный кислород, в результате чего наблюдается образование О ~2 и Н202; при этом чем выше р02, тем больше образуется О 2 и меньше - Н202 (в нормальных условиях около 70 % 02 переходит в Н202 ). В то же время нельзя забывать, что в ксантинде- гидрогеназной форме фермент также может восстанавливать кислород, хотя и менее эффективно, чем в оксидазной: в отсутствие НАД+ и в присутствии ксантина его V^ и Ктах для 02 составляют соответственно 25 и 600 % от значений, характерных для ксан- тиноксидазы . Более того, оба изоэнзима (оксидаза - в меньшей степени) про­являют НАДН-оксидазную активность: электроны с НАДН переносятся на ФАД (рис. 18), в результате последующего восстановления кислорода возникают О 2 и Н202 , при этом НАДН-оксидазная активность дегидрогеназ ной изоформы может достигать 40 % от собственно ксантиндегидрогеназной . В ксантиноксидазной реакции выяв­лено также образование радикала ОН*, который, как считают авторы, возникает в ре­зультате дальнейшего восстановления Н202 .

Активация ксантиноксидазы в эндотелиоцитах приводит к ингибированию N0- радикалов, что усиливает адгезию циркулирующих фагоцитов и агрегацию тромбоци­тов; так как N0* регулирует тонус сосудов, то гиперпродукция супероксид-аниона мо­жет привести к возникновению системной гипертензии - действительно, показано, что внутривенное введение ингибиторов ксантиноксидазы (аллопуринола, аллоксантина, деривата пиризалопиримидина) приводило к снижению кровяного давления у спонтанно гипертензивных крыс . В то же время недавно обнаружен парадоксальный факт: оказалось, что при низком парциальном давлении кислорода ксантиноксидоредуктаза может служить источником N0*, синтезируя его из нитратов и нитритов (как органиче­ских, так и неорганических) и используя в качестве источника электронов ксантин или НАДН (рис. 18) , поэтому некоторые исследователи считают фермент важ­ным источником вазодилататора N0* в ишемизированной ткани. При этом необходимо

учитывать, что в результате взаимодействия двух продуктов ферментативной активно­сти ксантиноксидоредуктазы, супероксид-аниона и оксида азота, образуется высокоре­акционный пероксинитрит, в чём вновь проявляется двойственность функций фермента.

Считается, что генерация АКМ ксантиноксидазой необходима для метаболизма же­леза , регуляции тонуса сосудов , клеточной пролиферации . Особое значение придаётся роли фермента в обеспечении врождённого иммунитета. В пользу барьерной, антимикробной роли ксантиноксидоредуктазы свидетельствует, в частности, её локализация - фермент преимущественно экспрессируется в эпителиаль­ных клетках, особенно в базальном и апикальном слоях кишечника, на люминалыюё поверхности эпителиоцитов желчных протоков, в гепатоцитах ; в эпителиальных слоях желудочно-кишечного тракта крыс гистохимически выявляются частично разру­шенные бактерии, окружённые молекулами ксантиноксидазы .

Для новорожденных дополнительным источником фермента, обеспечивающего ан­тимикробную защиту, служит молоко матери . Ксантиноксидоредуктаза пред­ставляет собой главный белковый компонент мембран, которые окружают капельки жи­ра свежевыработанного молока ; будучи производным соответствующих апикаль­ных мембран секреторных желез, они несут те же антигены, что и эпителиоциты. Поскольку для патогенных кишечных бактерий характерно сродство с антигенами мем­бран эпителиальных клеток желудочно-кишечного тракта, они столь же эффективно свя­зываются и с аналогичными антигенами мембран жировых глобул молока, тем самым вступая в тесный контакт с ксантиноксидоредуктазой ; усилению контакта способ­ствует высокая аффинность фермента к кислым полисахаридам, присутствующим в кле­точных стенках многих бактерий . Интересно, что активность ксантиноксидазы грудного молока у женщин резко возрастает в период лактации, достигая максимума (50-кратное увеличение) в первые 15 дней после родов и затем снижаясь до базального уровня к концу первого месяца. При этом содержание белка фермента изменяется незна­чительно, что свидетельствует о его посттрансляционной регуляции , которая, в частности, может осуществляться путём внедрения молибденового кофактора. Так, в ксантиноксидоредуктазе молока нелактирующих женщин менее 5 % сайтов связывания молибдоптерина заняты кофактором ; для коз и овец в периоды, не связанные с лактацией первых послеродовых недель, также характерна взаимосвязь низкой активно­
сти фермента молока с «запустением» молибденовых сайтов - занятость соответственно 9 и 18 % от теоретически возможной . В пользу роли фермента в обеспечении вро­ждённого иммунитета свидетельствуют эксперименты, выполненные на нокаутирован­ных по гену ксантиноксидоредуктазы мышах. Гомозиготные (-/-) животные погибали в первые 6 недель после рождения; гетерозиготы (+/-) выживали, имели нормальную фер­тильность и производили на свет полноценных мышат, которые, однако, погибали от голода вследствие нарушений лактации родительниц .

По-видимому, ксантиноксидаза участвует в защите организма при вирусных инфек­циях. Так, у мышей, инфицированных вирусом гриппа, наблюдалось значительное (в сотни раз) усиление активности ксантиноксидазы в лёгких . Продукция 02 и Н2О2 может оказаться столь мощной, что способна вызывать патологию, в результате чего животные погибают от пневмонии через 12 дней после инфицирования, при этом титры вируса в лёгких не определяются уже на 10 день. Введение аденозина (предшественник ксантина) снижало, а аллопуринол и СОД повышали выживаемость животных. Анало­гичные результаты получены при инфицировании мышей цитомегаловирусом. Одним из индукторов образования 02 при вирусных инфекциях выступает а-интерферон, кото­рый стимулирует транскрипцию ксантиндегидрогеназы, в последующем переходящей в оксидазную форму. В то же время необходимо помнить, что ксантиноксидоредуктаза - единственный метаболический источник мочевой кислоты, важного антиоксиданта вне­клеточных жидкостей (см. Главу 3), и повышение её активности при патологических состояниях может играть двойственную роль. Так, более чем 20-кратное увеличение содержания фермента в мозге больных бактериальным менингитом позволило авторам работы предположить, что присутствие и индуцибельность эндотелиальной ксан­тиноксидоредуктазы защищает эндотелий сосудов от окислительного повреждения при воспалении.

Показано, что 02, образующийся в ксантиноксидазной реакции, ингибирует Са2+- АТФазу саркоплазматического ретикулума гладкомышечных клеток сосудов, угнетая тем самым транспорт Са2+, что является одной из причин повреждения сосудов в раз­личных патологических ситуациях . Кроме того, 02 служит предшественни­ком других форм АКМ, в частности Н202 и ОН*, которые обладают более выраженным цитотоксическим действием. Поэтому оправдан интерес исследователей к разработке специфических ингибиторов ксантиноксидазы; в качестве таких ингибиторов широко применяются аллопуринол или его долгоживущий метаболит оксипуринол , а так­же альдегид птерина и фолиевая кислота .